western blot ne demek?

Western Blot (İmmünoblot)

Western blot, proteinleri tespit etmek ve analiz etmek için kullanılan yaygın bir laboratuvar tekniğidir. Genellikle "immünoblot" olarak da adlandırılır. Temel olarak, belirli bir proteinin bir numunede varlığını doğrulamak, protein miktarını belirlemek ve proteinin boyutunu ve post-translasyonel modifikasyonlarını incelemek için kullanılır.

Western Blot Aşamaları:

1. Numune Hazırlığı: Hücrelerden veya dokulardan protein içeren numuneler hazırlanır. Bu işlem, hücre lizizi Hücre Lizizi adı verilen bir yöntemle hücrelerin parçalanmasını içerir. Daha sonra proteinler solubilize edilir ve denatüre edilir.

2. Jel Elektroforezi: Proteinler, boyutlarına göre ayrılmaları için bir jel üzerinde elektroforeze tabi tutulur. Genellikle kullanılan jel türü, poliakrilamid jeldir (SDS-PAGE) SDS-PAGE. SDS (Sodyum Dodesil Sülfat), proteinleri denatüre eder ve onlara negatif bir yük vererek boyutlarına göre ayrılmalarını sağlar.

3. Transfer (Aktarım): Ayrılan proteinler, jelden bir membrana (genellikle nitroselüloz veya PVDF membrana) aktarılır. Bu işlem, elektroforetik olarak veya difüzyon yoluyla yapılabilir.

4. Bloklama: Membran, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bloklama solüsyonu (genellikle süt tozu veya BSA içeren bir solüsyon) ile inkübe edilir.

5. Antikor İnkübasyonu: Membran, hedeflenen proteini bağlamak için spesifik bir birincil antikor ile inkübe edilir. Daha sonra, birincil antikoru bağlamak için enzim veya floresan etiketli bir ikincil antikor kullanılır. Antikor

6. Sinyal Tespiti: İkincil antikora bağlı olan enzim (örn., HRP) veya floresan etiketi, bir substrat ile reaksiyona girerek bir sinyal üretir. Bu sinyal, film, CCD kamera veya floresan görüntüleme sistemi gibi yöntemlerle tespit edilir.

7. Analiz: Elde edilen bantların yoğunluğu ölçülerek protein miktarı belirlenebilir. Ayrıca, bantların konumu proteinin boyutunu gösterir.

Western Blot'un Kullanım Alanları:

• Protein Ekspresyon Analizi: Belirli bir proteinin hücre veya doku numunelerindeki ekspresyon seviyelerini belirlemek.
• Protein Modifikasyonlarının İncelenmesi: Fosforilasyon Fosforilasyon, glikosilasyon Glikosilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonların varlığını ve miktarını belirlemek.
• Tanı: Hastalıklarla ilişkili proteinlerin tespiti ve teşhisi.
• İlaç Geliştirme: İlaçların proteinler üzerindeki etkilerini incelemek.

Avantajları:

• Spesifik ve hassas bir yöntemdir.
• Proteinlerin boyutunu ve miktarını belirleyebilir.
• Çok çeşitli numunelerle kullanılabilir.

Dezavantajları:

• Zaman alıcı ve emek yoğun bir tekniktir.
• Antikorların kalitesi sonuçları etkileyebilir.
• Yüksek miktarda protein gerektirebilir.

Kategoriler